Geeninsiirron onnistuminen

[histoni]

Miten solukorvaushoidossa IPS-soluja tuotettaessa valitaan ne potilaan solut, joihin geeninsiirto on onnistunut? Antibioottivalintaa eikä elektroforeesiakaan voi käyttää, koska solut laitetaan takaisin potilaaseen. Käytetäänkö tässä jotain koetinta?

[Asetyylisalisyylihappo]

Aluksi potilaasta eristetään esimerkiksi ihon soluja, jotka tiettyjen geenien ja virusvektorien avulla saadaan ohjelmoitua iPS-soluiksi. Nämä iPS-solut saadaan taas erilaistumaan kasvutekijöiden ja kemiallisten aineiden avulla halutuiksi soluiksi, esimerkiksi suolen soluiksi. Geeninsiirron tiedetään onnistuneen, kun nähdään että ihmisestä eristetyt solut ovat uudelleenohjelmoitu iPS-soluiksi, joista pystyy erilaistumaan haluttuja soluja. Halutut solutyypit voidaan tunnistaa niiden tuttujen ominaisuuksien avulla tai kuvantamisella. Eihän erilaistumista halutuksi solutyypiksi tapahtuisi, jos geeninsiirto ei olisi onnistunut. Ehkä tämä selvensi.

[histoni]

Kiitos! Enpä tullut ajatelleeksi tuota. Luulen kuitenkin, että kyseessä täytyy olla jonkunlainen tunnistus esim koettimen avulla. Bios 5 -kirjassa nimittäin sanotaan iPS-tekniikassa seuraavasti: "Valitaan solut, joihin siirto on onnistunut ja kasvatetaan niistä kantasoluviljelmiä." Eli tämä tarkoittaisi sitä, että kaikkia viljelmän soluja ei suinkaan yritetä saada erilaistumaan kemiallisilla viestiaineilla, vaan vain siirtogeenisiin soluihin laitetaan viestiaineita. Bios 5 antaa vaihtoehdoiksi antibioottivalinnan, merkkigeenin, koettimen tai lähetti-RNA:n syntymisen, joten jollain näistä pitäisi varmaan tunnistaa iPS-solut.

[Asetyylisalisyylihappo]

Biologian kirjoissa tuntuu toisinaan olevan hieman epäselviä ja ehkä virheellisiäkin väitteitä. Asiaa kannattaa lähestyä konkreettisesti. Esimerkiksi ihosolut ovat erilaistuneita soluja, siksi ne eivät voi uudelleen erilaistua esimerkiksi punasoluiksi kasvutekijöiden tai kemiallisten aineiden avulla. Solujen valitseminen on siis turhaa, koska erilaistavat aineet eivät voi erilaistaa esimerkiksi erilaistuneita ihosoluja.


Antibioottivalinta toimii vain bakteeriviljelyssä. Merkkigeeni kuulostaa järkevältä: geenissä voi olla esimerkiksi fluoresoivaa proteiinia koodaava geeni. Eikö m-RNA ja koetin kuulu samaan soppaan?

[JakeVanLiner]

Vanha ketju, mutta vastailen silti jos joku tätä sattuu lukemaan. En tiedä mitenkä kirjassa tämä on mainittu mutta tässä suurinpiirtein mitenkä "oikeassa elämässä" asia suurinpiirtein menee.


Ensinnäkin yksittäisellä geenisiirrolla ei vielä saada aikaan juuri mitään potilasta hyödyttävää. IPS erilaistuksessa pitää oikeastaan käydä läpi se samanlainen erilaistumisreitti, jonka alkion solut käyvät läpi yksilönkehityksen aikana. Eli ensin indusoida IPS erilaistuminen joksikin alkiokerrokseksi ja siitä eteenpäin prekursorisoluiksi ja eteenpäin erilaistuneeksi suolityypiksi. Esimerkiksi suoliepiteelissä IPSC->endodermi->definitiivinen endodermi->posterioorinen definitiivinen endodermi->LGR5+ suolen kantasolut (CBC)->suolen epiteelin eri solutyypit. Tästä voi varmasti nähdä, että yksittäinen geenisiirto ei riitä mihinkään näistä vaiheista. Erilaistusaskeleet suoritetaan antamalla soluille erilaisia kasvutekijöitä. Nykyisin kasvutekijöitä voidaan myös osittain korvata (halvemmilla) kemiallisilla yhdisteillä (ns. pienmolekyylut), jotka aktivoivat tiettyjä signalointireittejä. Olkoonkin että itseasiassa pienmolekyylit ovat usein jonkin signalointimolekyylin estäjiä, mutta tämä puolestaan voi aktivoida muuta signalointireittiä tai vaihtoehtoisesti haluttu signalointireitti täytyy vaimentaa erilaistumisen saavuttamiseksi.


Yleisesti helppo keino arvioida yksittäisen geenisiirron onnistumista on fuusioida GFP:tä (green fluorescent protein) koodaava DNA mukaan siirrettävään geeniin. Kun siirtogeeni on onnistuneesti saatu siirrettyä kohdesoluun ja aktiivinen samalla tuotetaan GFP-mRNA ja siitä eteenpäin GFP-proteiini. GFP fluoresoi vihreää valoa kun sitä eksitoidaan 488nm valolla. Eli soluviljelmässä solut, jotka on onnistuneesti transformoitu hohtavat fluoresenssimikroskoopissa vihreänä kun annetaan 488 nm valoa. Sama pätee myös kokonaiseen elilöön, esimerkiksi monet ovat nähneet kuvia vihreänä hohtavista hiiristä.


Mikäli soluja meinataan laittaa oikeaan ihmispotilaaseen GFP:tä ei voi käyttää turvallisuussyistä. Eikä se mitään auttaisi, sillä kuten aikaisemmin sanottu IPS-soluja ei lähtökohtaisesti erilaisteta transfektiolla. Solujen erilaistumisastetta tutkitaan esimerkiksi qPCR:llä, jolla halutaan nähdä että halutulle solutyypille spesifisiä geenejä ekspressoidaan riittävästi ja ei-haluttuja ei ekspressoida. Esimerkiksi geenit jotka viittaavat pluripotenssikyvyn säilymiseen voivat altistaa myöhemmin syövälle, joten näitä ei saa ekspressoitua soluissa joita ollaan siirtämässä. qPCR mittaa mRNA:n tuotantoa, mutta tämä ei vielä välttämättä tarkoita sitä että mRNA transloituu proteiiniksi. Proteiinin ekspressiota voidaan tutkia esim. Western-blot mementelmällä ja proteiinin lokalisaatioita solussa immunovärjäyksellä. Näistä menetelmistä löytyy hyvät kuvaukset esim. wikipediasta. Lisäksi solujen funktionalisuutta täytyy tutkia, sillä toki solujen täytyy täyttää tehtävänsä myöhemmin osana kehoa. Näihin on kehitetty solutyyppispesifisiä menetelmiä joita ei ole mieltä esitellä tässä. Kuten langassa aikaisemmin mietittiin miten solujen käy näissä tutkimuksissa. Solut tosiaan menetetään (pl. GFP) mutta siirrettä varten soluja täytyy olla valtavat määrät ja osa näistä voidaan käyttää analyyseihin.


Terv, entinen kantasolutukija